आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग

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आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग की योजना

आइसोइलेक्ट्रिक फ़ोकसिंग (IEF), जिसे इलेक्ट्रोफ़ोकसिंग के रूप में भी जाना जाता है, विभिन्न अणुओं को उनके समविभव बिंदु (pI) में अंतर के द्वारा अलग करने की एक तकनीक है।[1][2] यह एक प्रकार का ज़ोन वैद्युतकणसंचलन है जो आमतौर पर एक जेल वैद्युतकणसंचलन में प्रोटीन पर किया जाता है जो इस तथ्य का लाभ उठाता है कि ब्याज के अणु पर समग्र प्रभार इसके परिवेश के पीएच का एक कार्य है।[3]


प्रक्रिया

आईईएफ में इम्मोबिलाइज्ड पीएच ग्रेडिएंट (आईपीजी) जैल में एक उभयधर्मिता समाधान जोड़ना शामिल है। IPGs एक्रिलामाइड जेल मैट्रिक्स हैं जो pH प्रवणता के साथ सह-बहुलकित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अधिकांश क्षारीय (>12) pH मानों को छोड़कर पूरी तरह से स्थिर प्रवणताएँ होती हैं। इमोबिलिन के अनुपात में निरंतर परिवर्तन से स्थिर पीएच ढाल प्राप्त होता है। एक इमोबिलिन एक कमजोर अम्ल या क्षार है जो इसके pK मान द्वारा परिभाषित होता है।

एक प्रोटीन जो अपने आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट (पीआई) के नीचे पीएच क्षेत्र में है, सकारात्मक रूप से चार्ज किया जाएगा और कैथोड (नकारात्मक चार्ज इलेक्ट्रोड) की तरफ माइग्रेट करेगा। जैसा कि यह बढ़ते पीएच के एक ढाल के माध्यम से माइग्रेट करता है, हालांकि, प्रोटीन का समग्र प्रभार तब तक कम हो जाएगा जब तक कि प्रोटीन पीएच क्षेत्र तक नहीं पहुंच जाता है जो इसके पीआई से मेल खाती है। इस बिंदु पर इसका कोई शुद्ध आवेश नहीं होता है और इसलिए प्रवासन समाप्त हो जाता है (क्योंकि किसी भी इलेक्ट्रोड की ओर कोई विद्युत आकर्षण नहीं होता है)। नतीजतन, प्रोटीन अपने पीआई के अनुरूप पीएच ग्रेडिएंट में एक बिंदु पर स्थित प्रत्येक प्रोटीन के साथ तेज स्थिर बैंड में केंद्रित हो जाते हैं। यह तकनीक अत्यधिक उच्च विभेदन में सक्षम है, जिसमें एक ही चार्ज द्वारा अलग-अलग बैंडों में अलग-अलग प्रोटीन होते हैं।

केंद्रित किए जाने वाले अणुओं को एक ऐसे माध्यम पर वितरित किया जाता है जिसमें पीएच प्रवणता होती है (आमतौर पर एलिफैटिक ampholyte ्स द्वारा बनाई जाती है)। एक विद्युत प्रवाह माध्यम से पारित किया जाता है, एक सकारात्मक एनोड और नकारात्मक कैथोड अंत बनाता है। नकारात्मक रूप से आवेशित अणु माध्यम में पीएच प्रवणता के माध्यम से धनात्मक अंत की ओर पलायन करते हैं जबकि धनात्मक रूप से आवेशित अणु ऋणात्मक अंत की ओर बढ़ते हैं। जैसे ही कोई कण अपने चार्ज के विपरीत ध्रुव की ओर बढ़ता है, यह बदलते पीएच प्रवणता के माध्यम से तब तक चलता है जब तक कि यह उस बिंदु तक नहीं पहुंच जाता है जिसमें उस अणु का पीएच आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु तक पहुंच जाता है। इस बिंदु पर अणु में शुद्ध विद्युत आवेश नहीं होता है (संबंधित कार्यात्मक समूहों के प्रोटोनेशन या डीप्रोटोनेशन के कारण) और इस तरह जेल के भीतर आगे नहीं बढ़ेगा। वैद्युतकणसंचलन के लिए अलग-अलग पीआई मानों के साथ एम्फ़ोलिट्स जैसे छोटे अणुओं के समाधान को पहले विषय के रूप में ब्याज के कणों को जोड़ने से पहले ढाल की स्थापना की जाती है।

विधि विशेष रूप से अक्सर प्रोटीन के अध्ययन में लागू होती है, जो अम्लीय और बेस (रसायन) एमिनो एसिड की सापेक्ष सामग्री के आधार पर अलग होती है, जिसका मूल्य पीआई द्वारा दर्शाया जाता है। प्रोटीन को polyacrylamide , स्टार्च, या एग्रोज से बने एक स्थिर पीएच ग्रेडियेंट जेल में पेश किया जाता है जहां पीएच ग्रेडियेंट स्थापित किया गया है। इस प्रक्रिया में आमतौर पर बड़े छिद्रों वाले जैल का उपयोग किया जाता है ताकि विभिन्न आकारों के प्रोटीन के लिए अलग-अलग प्रवासन दरों के कारण होने वाले पीआई में किसी भी प्रभाव या कलाकृतियों को खत्म किया जा सके। आइसोइलेक्ट्रिक फ़ोकसिंग प्रोटीन को हल कर सकता है जो आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु मान में 0.01 से कम भिन्न होता है।[4] आइसोइलेक्ट्रिक फ़ोकसिंग द्वि-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन में पहला कदम है, जिसमें प्रोटीन को पहले उनके पीआई मान से अलग किया जाता है और फिर एसडीएस-पृष्ठ के माध्यम से आणविक भार द्वारा अलग किया जाता है। आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग QPNC-PAGE|प्रारंभिक एक-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन में एकमात्र कदम है।

जीवित कोशिकाएं

कुछ मतों के अनुसार,[5][6] जीवित यूकेरियोटिक कोशिकाएं एंजाइमों और उनके अभिकारकों के प्रसार द्वारा चयापचय प्रतिक्रिया की दर की सीमा को दूर करने और विशेष जैव रासायनिक प्रक्रियाओं की दर को विनियमित करने के लिए अपने आंतरिक भाग में प्रोटीन का आइसोइलेक्ट्रिक ध्यान केंद्रित करती हैं। विशेष उपापचयी मार्गों के एंजाइमों को अपने आंतरिक भाग के विशिष्ट और छोटे क्षेत्रों में केंद्रित करके, कोशिका परिमाण के कई आदेशों द्वारा विशेष जैव रासायनिक मार्गों की दर को बढ़ा सकती है। एक एंजाइम के अणुओं के आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु (पीआई) के संशोधन द्वारा, उदाहरण के लिए, फास्फारिलीकरण या डीफोस्फोराइलेशन, कोशिका अपने आंतरिक के विभिन्न भागों के बीच एंजाइम के अणुओं को स्थानांतरित कर सकती है, विशेष जैव रासायनिक प्रक्रियाओं को चालू या बंद कर सकती है।

माइक्रोफ्लुइडिक चिप आधारित

माइक्रोचिप आधारित वैद्युतकणसंचलन केशिका वैद्युतकणसंचलन का एक आशाजनक विकल्प है क्योंकि इसमें तेजी से प्रोटीन विश्लेषण, अन्य माइक्रोफ्लुइडिक यूनिट संचालन के साथ सीधा एकीकरण, पूरे चैनल का पता लगाने, नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्मों, छोटे नमूना आकार और कम निर्माण लागत प्रदान करने की क्षमता है।

मल्टी-जंक्शन

तेजी से और आसानी से उपयोग होने वाले प्रोटीन पृथक्करण उपकरणों की बढ़ती मांग ने आईईएफ के इन-सॉल्यूशन अलगाव की दिशा में विकास को गति दी है। इस संदर्भ में, तेजी से और जेल मुक्त आईईएफ अलगाव करने के लिए एक बहु-जंक्शन आईईएफ प्रणाली विकसित की गई थी। बहु-जंक्शन आईईएफ प्रणाली जहाजों की एक श्रृंखला का उपयोग करती है जिसमें प्रत्येक पोत के माध्यम से एक केशिका गुजरती है।[7]प्रत्येक पोत में केशिका का हिस्सा एक अर्धपारगम्य झिल्ली द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। वाहिकाओं में विभिन्न पीएच मान के साथ बफर समाधान होते हैं, ताकि केशिका के अंदर एक पीएच ढाल प्रभावी रूप से स्थापित हो। प्रत्येक पोत में बफर समाधान में एक उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति से जुड़े वोल्टेज डिवाइडर के साथ एक विद्युत संपर्क होता है, जो केशिका के साथ विद्युत क्षेत्र स्थापित करता है। जब एक नमूना (पेप्टाइड्स या प्रोटीन का मिश्रण) केशिका में इंजेक्ट किया जाता है, विद्युत क्षेत्र की उपस्थिति और पीएच ढाल इन अणुओं को उनके आइसोइलेक्ट्रिक बिंदुओं के अनुसार अलग करता है। बहु-जंक्शन IEF प्रणाली का उपयोग द्वि-आयामी प्रोटिओमिक्स के लिए ट्राइप्टिक पेप्टाइड मिश्रण को अलग करने के लिए किया गया है [8] और बायोमार्कर खोज के लिए अल्जाइमर रोग रोगियों से रक्त प्लाज्मा प्रोटीन।[7]


संदर्भ

  1. ↑ Bjellqvist, Bengt; Ek, Kristina; Righetti, Pier Giorgio; Gianazza, Elisabetta; Görg, Angelika; Westermeier, Reiner; Postel, Wilhelm (1982). "Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: Principle, methodology and some applications". Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 6 (4): 317–339. doi:10.1016/0165-022X(82)90013-6. ISSN 0165-022X. PMID 7142660.
  2. ↑ Pier Giorgio Righetti (1 April 2000). Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Application. Elsevier. ISBN 978-0-08-085880-7.
  3. ↑ David Edward Garfin (1990). Isoelectric focusing. Methods in Enzymology. Vol. 182. pp. 459–77. doi:10.1016/0076-6879(90)82037-3. ISBN 9780121820831. PMID 2314254.
  4. ↑ Stryer, Lubert: "Biochemie", page 50. Spektrum Akademischer Verlag, 1996 (German)
  5. ↑ Flegr J (1990). "Does a cell perform isoelectric focusing?" (PDF). BioSystems. 24 (2): 127–133. doi:10.1016/0303-2647(90)90005-L. PMID 2249006.
  6. ↑ Baskin E.F.; Bukshpan S; Zilberstein G V (2006). "पीएच-प्रेरित इंट्रासेल्युलर प्रोटीन परिवहन". Physical Biology. 3 (2): 101–106. Bibcode:2006PhBio...3..101B. doi:10.1088/1478-3975/3/2/002. PMID 16829696. S2CID 41599078.
  7. ↑ 7.0 7.1 Pirmoradian M.; Astorga-Wells, J., Zubarev, RA. (2015). "मल्टीजंक्शन कैपिलरी आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग डिवाइस ऑनलाइन मेम्ब्रेन-असिस्टेड बफर एक्सचेंजर के साथ संयुक्त बायोमार्कर डिस्कवरी के लिए बरकरार मानव प्लाज्मा प्रोटीन के आइसोइलेक्ट्रिक प्वाइंट फ्रैक्शनेशन को सक्षम करता है।" (PDF). Analytical Chemistry. 87 (23): 11840–11846. doi:10.1021/acs.analchem.5b03344. hdl:10616/44920. PMID 26531800.{{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  8. ↑ Pirmoradian, M.; Zhang, B.; Chingin, K.; Astorga-Wells, J.; Zubarev R.A. (2014). "दो आयामी शॉटगन प्रोटिओमिक्स के लिए सूक्ष्म-प्रारंभिक अंशक के रूप में मेम्ब्रेन-असिस्टेड आइसोइलेक्ट्रिक फ़ोकसिंग डिवाइस". Analytical Chemistry. 86 (12): 5728–5732. doi:10.1021/ac404180e. PMID 24824042.
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