तापमान ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन

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एथिडियम ब्रोमाइड-सना हुआ DGGE जेल की नकारात्मक छवि

तापमान ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन (टीजीजीई) और डिनाट्यूरिंग ग्रेडिएंट जेल वैद्युतकणसंचलन (डीजीजीई) वैद्युतकणसंचलन के रूप हैं जो नमूने को विकृत करने के लिए तापमान या रासायनिक प्रवणता का उपयोग करते हैं क्योंकि यह एक्रिलामाइड जेल में चलता है। टीजीजीई और डीजीजीई को न्यूक्लिक एसिड जैसे डीएनए और आरएनए, और (कम सामान्यतः) प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है। टीजीजीई न्यूक्लिक एसिड को अलग करने के लिए संरचना में तापमान पर निर्भर परिवर्तनों पर निर्भर करता है। DGGE एक ही आकार के जीन को उनकी अलग-अलग विकृतीकरण क्षमता के आधार पर अलग करता है जो उनके आधार जोड़ी अनुक्रम द्वारा निर्धारित किया जाता है। DGGE मूल तकनीक थी, और TGGE इसका परिशोधन।

इतिहास

DGGE का आविष्कार लियोनार्ड लर्मन ने किया था, जबकि वह SUNY अल्बानी में प्रोफेसर थे।[1][2][3] प्रोटीन के विश्लेषण के लिए उन्हीं उपकरणों का इस्तेमाल किया जा सकता है, जो सबसे पहले एमआरसी आणविक जीव विज्ञान की प्रयोगशाला, कैम्ब्रिज, इंग्लैंड के थॉमस ई. क्रेयटन ने किया था।[4] समान दिखने वाले पैटर्न प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड द्वारा निर्मित होते हैं, लेकिन मौलिक सिद्धांत काफी भिन्न होते हैं।

टीजीजीई का वर्णन सबसे पहले थैचर और हॉडसन ने किया था [5] और जॉर्जिया टेक के रोजर वारटेल द्वारा। जर्मनी में रिस्नेर के समूह द्वारा व्यापक कार्य किया गया था। डीजीजीई के लिए वाणिज्यिक उपकरण बायो-रेड, इंजेनी और सीबीएस साइंटिफिक से उपलब्ध है; बायोमेट्रा से टीजीजीई के लिए एक प्रणाली उपलब्ध है।

तापमान ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन

डीएनए का ऋणात्मक आवेश होता है और इसलिए यह एक विद्युत क्षेत्र में धनात्मक इलेक्ट्रोड में चला जाएगा। एक जेल एक आणविक जाल है, जिसमें छेद लगभग डीएनए स्ट्रिंग के व्यास के समान आकार के होते हैं। जब एक विद्युत क्षेत्र लागू किया जाता है, तो डीएनए जेल के माध्यम से गति करना शुरू कर देगा, डीएनए अणु की लंबाई के विपरीत आनुपातिक गति से (डीएनए की छोटी लंबाई तेजी से यात्रा करती है) - यह मानक वैद्युतकणसंचलन में आकार पर निर्भर पृथक्करण का आधार है .

TGGE में जेल के आर-पार एक तापमान प्रवणता भी होती है। कमरे के तापमान पर, डीएनए एक डबल-फंसे हुए रूप में स्थिर रूप से मौजूद रहेगा। जैसे-जैसे तापमान बढ़ता है, किस्में अलग होने लगती हैं (डीएनए का पिघलना), और जिस गति से वे जेल के माध्यम से आगे बढ़ते हैं वह काफी कम हो जाता है। गंभीर रूप से, जिस तापमान पर पिघलना होता है, वह अनुक्रम पर निर्भर करता है (जीसी बेसपेयर स्टैकिंग इंटरैक्शन के कारण एटी की तुलना में अधिक स्थिर होते हैं, हाइड्रोजन बॉन्ड में अंतर के कारण नहीं[citation needed] (साइटोसिन और ग्वानिन बेस पेयर के बीच तीन हाइड्रोजन बॉन्ड होते हैं, लेकिन एडीनाइन और थाइमिन के बीच केवल दो)), इसलिए TGGE डीएनए अणुओं को अलग करने के लिए एक अनुक्रम निर्भर, आकार स्वतंत्र विधि प्रदान करता है। टीजीजीई अणुओं को अलग करता है और पिघलने के व्यवहार और स्थिरता के बारे में अतिरिक्त जानकारी देता है (बायोमेट्रा, 2000)।

विकृतीकरण जेल वैद्युतकणसंचलन

डिनाट्यूरिंग ग्रेडिएंट जेल वैद्युतकणसंचलन (डीजीजीई) एक वैद्युतकणसंचलन जेल में डीएनए (या आरएनए) के एक छोटे से नमूने को लागू करके काम करता है जिसमें एक विकृतीकरण (जैव रसायन) एजेंट होता है। शोधकर्ताओं ने पाया है कि कुछ डिनाट्यूरिंग जैल डीएनए को विभिन्न चरणों में पिघलने के लिए प्रेरित करने में सक्षम हैं। इस पिघलने के परिणामस्वरूप, डीएनए जेल के माध्यम से फैलता है और एकल घटकों के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, यहां तक ​​कि 200-700 बेस जोड़े जितना छोटा भी।

डीजीजीई तकनीक के बारे में जो अद्वितीय है वह यह है कि जैसे-जैसे डीएनए तेजी से अत्यधिक विकृतीकरण की स्थिति के अधीन होता है, पिघले हुए तार पूरी तरह से एकल किस्में में खंडित हो जाते हैं। डिनाट्यूरिंग जेल पर विकृतीकरण की प्रक्रिया बहुत तेज होती है: निरंतर जिपर की तरह आंशिक रूप से पिघलने के बजाय, अधिकांश टुकड़े एक चरणबद्ध प्रक्रिया में पिघलते हैं। टुकड़े के असतत भाग या डोमेन अचानक विकृतीकरण स्थितियों (हेल्स, 1990) की एक बहुत ही संकीर्ण सीमा के भीतर एकल-फंसे हो जाते हैं। यह डीएनए अनुक्रमों या विभिन्न जीनों के उत्परिवर्तनों में अंतर को समझना संभव बनाता है: समान लंबाई के टुकड़ों में अनुक्रम अंतर अक्सर उन्हें ढाल में विभिन्न स्थितियों पर आंशिक रूप से पिघला देता है और इसलिए जेल में विभिन्न स्थितियों पर रुक जाता है। बहुरूपता (जीव विज्ञान) डीएनए के टुकड़े के पिघलने वाले व्यवहार की तुलना ग्रेडिएंट जैल के साथ-साथ करने से, उन टुकड़ों का पता लगाना संभव है, जिनमें पहले पिघलने वाले डोमेन (हेल्म्स, 1990) में उत्परिवर्तन होता है। दो नमूनों को जेल पर साथ-साथ रखकर और उन्हें एक साथ विकृतीकरण (जैव रसायन) की अनुमति देकर, शोधकर्ता दो नमूनों या डीएनए के टुकड़ों में सबसे छोटे अंतर को भी आसानी से देख सकते हैं।

इस तकनीक के कई नुकसान हैं: डीजीजीई में उपयोग किए जाने वाले जैसे रासायनिक ग्रेडियेंट पुनरुत्पादित नहीं होते हैं, स्थापित करना मुश्किल होता है और अक्सर हेटेरोडुप्लेक्स (वेस्टबर्ग, 2001) को पूरी तरह से हल नहीं करते हैं। इन समस्याओं को टीजीजीई द्वारा संबोधित किया जाता है, जो नमूने को विकृत करने के लिए रासायनिक ढाल के बजाय तापमान का उपयोग करता है।

विधि

टीजीजीई द्वारा न्यूक्लिक एसिड को अलग करने के लिए, निम्नलिखित चरणों का पालन किया जाना चाहिए: जैल तैयार करना और डालना, वैद्युतकणसंचलन, धुंधला हो जाना और डीएनए का क्षालन। क्योंकि बफर द्रावण सिस्टम को चुना जाना चाहिए, यह महत्वपूर्ण है कि बढ़ते तापमान के संदर्भ में सिस्टम स्थिर रहे। इस प्रकार, यूरिया का उपयोग आमतौर पर जेल तैयार करने के लिए किया जाता है; हालांकि, शोधकर्ताओं को यह जानने की जरूरत है कि उपयोग की जाने वाली यूरिया की मात्रा डीएनए को अलग करने के लिए आवश्यक समग्र तापमान को प्रभावित करेगी।[6] जेल लोड किया जाता है, जेल के प्रकार के अनुसार नमूना जेल पर रखा जाता है- यानी चलाया जा रहा है। समानांतर या लंबवत - वोल्टेज समायोजित किया जाता है और नमूना चलाने के लिए छोड़ा जा सकता है।[6]किस प्रकार के टीजीजीई को चलाना है, इस पर निर्भर करते हुए, या तो लंबवत या समानांतर (ज्यामिति), अलग-अलग मात्रा में नमूना तैयार करने और लोड करने की आवश्यकता होती है। लंबवत के साथ एक नमूने की एक बड़ी मात्रा का उपयोग किया जाता है, जबकि समानांतर टीजीजीई के साथ कई नमूनों की एक छोटी मात्रा का उपयोग किया जाता है। एक बार जेल चलाए जाने के बाद, परिणामों की कल्पना करने के लिए जेल को दाग देना चाहिए। जबकि इस उद्देश्य के लिए कई प्रकार के दागों का उपयोग किया जा सकता है, स्टेनिंग (जीव विज्ञान)#सिल्वर स्टेनिंग सबसे प्रभावी उपकरण साबित हुआ है।[6]पोलीमरेज श्रृंखला अभिक्रिया एम्प्लीफिकेशन के माध्यम से आगे के विश्लेषण के लिए डीएनए को चांदी के दाग से अलग किया जा सकता है।[6]


अनुप्रयोग

टीजीजीई और डीजीजीई बायोमेडिकल और पारिस्थितिक अनुसंधान में व्यापक रूप से उपयोगी हैं; चयनित अनुप्रयोगों का वर्णन नीचे किया गया है।

एमटीडीएनए में उत्परिवर्तन

वोंग, लियांग, क्वोन, बाई, एल्पर और ग्रोपमैन की हालिया जांच के अनुसार,[7] टीजीजीई का उपयोग किसी व्यक्ति के माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की जांच के लिए किया जा सकता है। इन लेखकों के अनुसार, टीजीजीई का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम में दो उपन्यास उत्परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया गया था: एक 21 वर्षीय महिला जिसे माइटोकॉन्ड्रियल साइटोपैथी का संदेह है, लेकिन सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) बिंदु उत्परिवर्तन और विलोपन के लिए नकारात्मक, जांच की गई थी तापमान ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पूरे माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम में अज्ञात उत्परिवर्तन।[8]


अग्न्याशय के स्राव में p53 उत्परिवर्तन

लोहर और सहकर्मियों (2001) की रिपोर्ट[citation needed] कि अग्नाशयी कार्सिनोमा के बिना व्यक्तियों के अग्नाशयी स्राव के व्यापक अध्ययन में, प्रतिभागियों के एक छोटे प्रतिशत के अग्नाशयी रस में p53 उत्परिवर्तन पाया जा सकता है। क्योंकि अग्नाशयी कार्सिनोमा में p53 के उत्परिवर्तन बड़े पैमाने पर पाए गए हैं, इस जांच के लिए शोधकर्ता यह निर्धारित करने का प्रयास कर रहे थे कि उत्परिवर्तन को अग्नाशयी कैंसर के विकास से जोड़ा जा सकता है या नहीं। जबकि लोहर कुछ विषयों में TGGE के माध्यम से p53 म्यूटेशन खोजने में सक्षम था, बाद में किसी ने भी अग्नाशयी कार्सिनोमा विकसित नहीं किया। इस प्रकार, शोधकर्ता यह देखते हुए निष्कर्ष निकालते हैं कि p53 उत्परिवर्तन अग्नाशयी कार्सिनोमा ऑन्कोजेनेसिस का एकमात्र संकेतक नहीं हो सकता है।

माइक्रोबियल पारिस्थितिकी

छोटे राइबोसोमल सबयूनिट कोडिंग जीन के DGGE को सबसे पहले जेरार्ड मुइज़र द्वारा वर्णित किया गया था,[9] जब वह लीडेन विश्वविद्यालय में पोस्ट-डॉक्टर थे, और माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक बन गई है।

जीवाणु और आर्किया के 16S rRNA जीन अंशों के लिए विशिष्ट PCR प्राइमरों के साथ मिश्रित माइक्रोबियल समुदायों से निकाले गए डीएनए का PCR प्रवर्धन, और यूकैर्योसाइटों के 18S rRNA जीन अंशों के परिणामस्वरूप PCR उत्पादों का मिश्रण होता है। क्योंकि इन एम्पलीकॉन्स की लंबाई समान होती है, इसलिए उन्हें agarose gel वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक दूसरे से अलग नहीं किया जा सकता है। हालांकि, विभिन्न माइक्रोबियल rRNAs के बीच अनुक्रम भिन्नता (यानी जीसी सामग्री और वितरण में अंतर) के परिणामस्वरूप इन डीएनए अणुओं के विभिन्न विकृतीकरण गुण होते हैं।

इसलिए, DGGE बैंडिंग पैटर्न का उपयोग माइक्रोबियल आनुवंशिक विविधता में भिन्नता की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है और प्रमुख माइक्रोबियल समुदाय के सदस्यों की बहुतायत की समृद्धि का मोटा अनुमान प्रदान करता है। इस पद्धति को अक्सर सामुदायिक फ़िंगरप्रिंटिंग के रूप में जाना जाता है। हाल ही में, कई अध्ययनों से पता चला है कि कार्यात्मक जीन के डीजीजीई (उदाहरण के लिए सल्फर में कमी, नाइट्रोजन स्थिरीकरण और अमोनियम ऑक्सीकरण में शामिल जीन) एक साथ माइक्रोबियल फ़ंक्शन और फाइलोजेनी के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, तबताबाई एट अल। (2009) ने डीजीजीई लागू किया और पहली बार पाम ऑयल मिल एफ्लुएंट (पीओएमई) के अवायवीय किण्वन के दौरान माइक्रोबियल पैटर्न प्रकट करने में कामयाब रहे।[10]


संदर्भ

  1. ↑ Cell. 1979 Jan;16(1):191-200. Length-independent separation of DNA restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis. Fischer SG, Lerman LS
  2. ↑ Fischer S. G. and Lerman L. S. "Separation of random fragments of DNA according to properties of their sequences" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 4420-4424.
  3. ↑ Fischer S. G. and Lerman L. S. "DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: Correspondence with melting theory" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 1579-1583.
  4. ↑ J Mol Biol. 1994 Oct 7;242(5):670-82. Electrophoretic characterization of the denatured states of staphylococcal nuclease. Creighton TE, Shortle D.
  5. ↑ Bioochem. J. (1981) 197, 105-109
  6. ↑ 6.0 6.1 6.2 6.3 (Biometra, 2000).[citation needed]
  7. ↑ L‐J C Wong, D Yim, R‐K Bai, H Kwon, M M Vacek, J Zane, C L Hoppel e D S Kerr. A novel mutation in the mitochondrial tRNASer(AGY) gene associated with mitochondrial myopathy, encephalopathy, and complex I deficiency. J Med Genet. Stembro de 2006 ; 43(9): e46. doi: 10.1136/jmg.2005.040626. PMCID: PMC2564579. PMID 16950817 .
  8. ↑ (Wong et al., 2002).[citation needed]
  9. ↑ Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG. (1993) Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol. 59:695-700.
  10. ↑ PCR-Based DGGE and FISH Analysis of Methanogens in Anaerobic Closed Digester Tank Treating Palm Oil Mill Effluent. Meisam Tabatabaei, Mohd Rafein Zakaria, Raha Abdul Rahim, André-Denis G. Wright, Yoshihito Shirai, Norhani Abdullah, Kenji Sakai, Shinya Ikeno, Masatsugu Mori, Nakamura Kazunori, Alawi Sulaiman and Mohd Ali Hassan, 2009, Electronic Journal of Biotechnology, Vol.12 No.3, Issue of 15 July 2009, ISSN 0717-3458
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