इलेक्ट्रोफोरमैटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख

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लेन 1 एक नकारात्मक नियंत्रण है, और इसमें केवल आनुवंशिक सामग्री होती है। लेन 2 में प्रोटीन के साथ-साथ एक डीएनए टुकड़ा भी होता है, जो इसके अनुक्रम के आधार पर परस्पर क्रिया नहीं करता है। लेन 3 में प्रोटीन और डीएनए का एक टुकड़ा होता है जो प्रतिक्रिया करता है; परिणामी परिसर बड़ा, भारी और धीमी गति से चलने वाला होता है। लेन 3 में दिखाया गया पैटर्न वह है जो परिणाम देगा यदि सभी डीएनए बंधे हुए थे और वैद्युतकणसंचलन के दौरान जटिल का कोई पृथक्करण नहीं हुआ था। जब इन स्थितियों को पूरा नहीं किया जाता है तो लेन 3 में एक दूसरा बैंड देखा जा सकता है जो मुक्त डीएनए की उपस्थिति या डीएनए-प्रोटीन परिसर के पृथक्करण को दर्शाता है।

एक इलेक्ट्रोफोरमैटिक मोबिलिटी शिफ्ट एसे (EMSA) या मोबिलिटी शिफ्ट इलेक्ट्रोफोरेसिस, जिसे जेल शिफ्ट एसे, जेल मोबिलिटी शिफ्ट एसे, बैंड शिफ्ट एसे या जेल रिटार्डेशन एसे के रूप में भी शाही सेना जाता है, प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली एक सामान्य आत्मीयता वैद्युतकणसंचलन तकनीक है। प्रोटीन -डीएनए या प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन। यह प्रक्रिया यह निर्धारित कर सकती है कि प्रोटीन या प्रोटीन का मिश्रण किसी दिए गए डीएनए या आरएनए अनुक्रम को बाध्य करने में सक्षम है या नहीं, और कभी-कभी संकेत कर सकता है कि बाध्यकारी परिसर में एक से अधिक प्रोटीन अणु शामिल हैं या नहीं। प्रतिलेखन (आनुवांशिकी)आनुवांशिकी) दीक्षा, डीएनए गैंग प्रतिकृति, डीएनए मरम्मत या आरएनए प्रसंस्करण और परिपक्वता, साथ ही प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग का अध्ययन करते समय जेल शिफ्ट एसेज़ अक्सर कृत्रिम परिवेशीय में DNase पदचिह्न, प्राइमर एक्सटेंशन और प्रमोटर-जांच प्रयोगों के साथ किया जाता है।[1] हालांकि अग्रदूतों को पहले के साहित्य में पाया जा सकता है, अधिकांश वर्तमान परख गार्नर और रेवज़िन द्वारा वर्णित विधियों पर आधारित हैं [2] और फ्राइड और डोनाल्ड क्रॉथर।[3]


सिद्धांत

एक गतिशीलता बदलाव परख एक प्रोटीन-डीएनए या प्रोटीन-आरएनए मिश्रण का जेल वैद्युतकणसंचलन है, जो पॉलीएक्रिलामाइड जेल या अगारोज जेल पर एक छोटी अवधि (15- से 20-सेमी जेल के लिए लगभग 1.5-2 घंटे) के लिए होता है।[4] गति जिस पर विभिन्न अणु (और उसके संयोजन) जेल के माध्यम से चलते हैं, उनके आकार और आवेश से निर्धारित होता है, और कुछ हद तक, उनके आकार (जेल वैद्युतकणसंचलन देखें)। नियंत्रण लेन (प्रोटीन के बिना डीएनए जांच मौजूद) में अनबाउंड डीएनए या आरएनए टुकड़े के अनुरूप एक बैंड होगा। हालांकि, यह मानते हुए कि प्रोटीन टुकड़े को बांधने में सक्षम है, प्रोटीन के साथ मौजूद लेन में एक और बैंड होगा जो प्रोटीन से बंधे न्यूक्लिक एसिड जांच के बड़े, कम मोबाइल कॉम्प्लेक्स का प्रतिनिधित्व करता है जो जेल पर 'स्थानांतरित' होता है। (चूंकि यह अधिक धीमी गति से चला गया है)।

सही प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत, डीएनए (या आरएनए) और प्रोटीन के बीच बातचीत स्थिर हो जाती है और जेल पर बाध्य से अनबाउंड न्यूक्लिक एसिड का अनुपात मुक्त और बाध्य जांच अणुओं के अंश को दर्शाता है क्योंकि बाध्यकारी प्रतिक्रिया जेल में प्रवेश करती है। यह स्थिरता आंशिक रूप से पिंजरे के प्रभाव के कारण होती है, जिसमें प्रोटीन, जेल मैट्रिक्स से घिरा होता है, वे पुन: संयोजित होने से पहले जांच से अलग नहीं हो पाते हैं।[5] यदि प्रोटीन और जांच की प्रारंभिक सांद्रता ज्ञात है, और यदि परिसर की स्टोइकोमेट्री ज्ञात है, तो न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम के लिए प्रोटीन की स्पष्ट आत्मीयता निर्धारित की जा सकती है।[6] जब तक परिसर बहुत लंबे समय तक जेल की स्थिति में रहता है, या वैद्युतकणसंचलन के दौरान पृथक्करण को ध्यान में रखा जाता है, तो व्युत्पन्न संख्या एक स्पष्ट केडी है। यदि प्रोटीन सांद्रता ज्ञात नहीं है, लेकिन जटिल स्टोइकोमेट्री है, तो डीएनए जांच की एकाग्रता को बढ़ाकर प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण किया जा सकता है जब तक कि आगे की वृद्धि प्रोटीन के अंश में वृद्धि नहीं करती है। एक ही जेल पर चलने वाले नि: शुल्क जांच के मानक कमजोर पड़ने के एक सेट के साथ तुलना करके, प्रोटीन के मोल्स की संख्या की गणना की जा सकती है।[4]


वेरिएंट और परिवर्धन

एक एंटीबॉडी जो प्रोटीन को पहचानती है, इस मिश्रण में एक बड़ी शिफ्ट के साथ एक बड़ा कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए जोड़ा जा सकता है। इस पद्धति को सुपरशिफ्ट परख के रूप में संदर्भित किया जाता है, और इसका उपयोग प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड कॉम्प्लेक्स में मौजूद प्रोटीन की स्पष्ट रूप से पहचान करने के लिए किया जाता है।

बाध्यकारी प्रोटीन के लिए सबसे अनुकूल बाध्यकारी अनुक्रम निर्धारित करने के लिए अक्सर, एक अतिरिक्त लेन प्रतिस्पर्धी oligonucleotide के साथ चलाया जाता है। परिभाषित अनुक्रम के विभिन्न ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग प्रतियोगिता द्वारा सटीक बाध्यकारी साइट की पहचान की अनुमति देता है (आरेख में नहीं दिखाया गया है)। प्रतियोगिता परख के वेरिएंट बाध्यकारी की विशिष्टता को मापने और एसोसिएशन और पृथक्करण कैनेटीक्स के मापन के लिए उपयोगी होते हैं। इस प्रकार, EMSA का उपयोग SELEX प्रयोग के हिस्से के रूप में भी किया जा सकता है ताकि ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का चयन किया जा सके जो वास्तव में किसी दिए गए प्रोटीन को बांधते हैं।[citation needed]

एक बार डीएनए-प्रोटीन बाइंडिंग इन विट्रो में निर्धारित हो जाने के बाद, कई एल्गोरिदम ट्रांसक्रिप्शन कारक की पहचान के लिए खोज को कम कर सकते हैं। ब्याज के प्रतिलेखन कारक के लिए सर्वसम्मति अनुक्रम ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स बंधन के लिए प्रतिस्पर्धा करने में सक्षम होंगे, शिफ्ट किए गए बैंड को समाप्त कर देंगे, और सुपरशफ्ट द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए। यदि पूर्वानुमानित आम सहमति अनुक्रम बाध्यकारी के लिए प्रतिस्पर्धा करने में विफल रहता है, तो प्रतिलेखन कारक की पहचान बहुसंकेतन प्रतियोगी ईएमएसए (एमसी-ईएमएसए) द्वारा सहायता प्राप्त हो सकती है, जिससे सर्वसम्मति अनुक्रमों के बड़े सेट प्रत्येक प्रतिक्रिया में बहुसंकेतन होते हैं, और जहां एक सेट बंधन के लिए प्रतिस्पर्धा करता है, इस सेट से अलग-अलग आम सहमति क्रम आगे की प्रतिक्रिया में चलाए जाते हैं।[7] विज़ुअलाइज़ेशन उद्देश्यों के लिए, न्यूक्लिक एसिड के टुकड़े को आमतौर पर एक समस्थानिक लेबलिंग , फ्लोरोसेंट मार्कर या biotinylation लेबल के साथ लेबल किया जाता है। मानक ऐथिडियम ब्रोमाइड अभिरंजक इन विधियों की तुलना में कम संवेदनशील होता है और न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता की कमी हो सकती है यदि इन प्रयोगों में न्यूक्लिक एसिड या सिंगल-स्ट्रैंडेड न्यूक्लिक एसिड की थोड़ी मात्रा का उपयोग किया जाता है। बायोटिन लेबल का उपयोग करते समय, हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज जैसे एंजाइम से संयुग्मित streptavidin का उपयोग डीएनए के टुकड़े का पता लगाने के लिए किया जाता है।[8][9] जबकि आइसोटोपिक डीएनए लेबलिंग का प्रोटीन बाइंडिंग एफ़िनिटी पर बहुत कम या कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, फ्लोरोफ़ोर्स या बायोटिन सहित गैर-आइसोटोपिक लेबल का उपयोग रुचि के प्रोटीन इंटरेक्शन की एफ़िनिटी और/या स्टोइकोमेट्री को बदल सकता है। फ्लोरोफोर- या बायोटिन-लेबल जांच और एक ही अनुक्रम के बिना लेबल वाले डीएनए के बीच प्रतिस्पर्धा का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या लेबल बाध्यकारी आत्मीयता या स्टोइकोमेट्री को बदल देता है।

संदर्भ

  1. ↑ Granadino B, Penalva LO, Green MR, Valcarcel J, Sanchez L. 1997. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 7343-8.
  2. ↑ Garner MM, Revzin A (July 1981). "A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system". Nucleic Acids Res. 9 (13): 3047–60. doi:10.1093/nar/9.13.3047. PMC 327330. PMID 6269071.
  3. ↑ Fried M, Crothers DM (December 1981). "पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा लाख रिप्रेसर-ऑपरेटर इंटरैक्शन के संतुलन और कैनेटीक्स". Nucleic Acids Res. 9 (23): 6505–25. doi:10.1093/nar/9.23.6505. PMC 327619. PMID 6275366.
  4. ↑ 4.0 4.1 Ausubel, Frederick M. (1994). मॉलीक्यूलर जीवविज्ञान में वर्तमान प्रोटोकाल. Chichester: John Wiley & Sons. pp. 12.2.1–11. ISBN 0-471-50337-1.
  5. ↑ Fried MG, Liu G (1994). "पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन के दौरान आणविक पृथक्करण सीएपी-डीएनए परिसरों को स्थिर करता है". Nucleic Acids Research. 22 (23): 5054–5059. doi:10.1093/nar/22.23.5054. PMC 523777. PMID 7800499.
  6. ↑ Fried MG (1989). "वैद्युतकणसंचलन गतिशीलता शिफ्ट परख द्वारा प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन मापदंडों का मापन". Electrophoresis. 10 (5–6): 366–376. doi:10.1002/elps.1150100515. PMID 2670548. S2CID 19372331.
  7. ↑ Smith AJ, Humphries SE (January 2009). "बहुसंकेतन प्रतियोगी ईएमएसए का उपयोग करके डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन की विशेषता". J. Mol. Biol. 385 (3): 714–7. doi:10.1016/j.jmb.2008.11.035. PMID 19059416.
  8. ↑ Hellman, Lance M; Fried, Michael G (2007). "Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein–nucleic acid interactions". Nature Protocols. 2 (8): 1849–1861. doi:10.1038/nprot.2007.249. ISSN 1754-2189. PMC 2757439. PMID 17703195.
  9. ↑ ऑस्मोसेंसिंग और ऑस्मोसिग्नलिंग. Academic Press. 1 October 2007. pp. 288–. ISBN 978-0-08-055211-8.


बाहरी संबंध

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